Als echtes frühes Zentrum des Franziskanertums wurde die Portiunkula zu einem der wichtigsten Pilgerorte, so dass Papst Pius V. nach dem Konzil von Trient beschloss, diese großartige Basilika zu errichten, um dem Orden der Minderbrüder neues Leben einzuhauchen und den vielen Gläubigen, die die Portiunkula bereits besuchten, einen angemessenen Empfang zu bieten. Die dreischiffige Kirche mit dem nicht vorspringenden Querschiff, dem Grundriss einer Kreuzkuppel und der halbkreisförmigen Apsis wurde von Galeazzo Alessi entworfen und 1679 mit dem Bau des Glockenturms auf der rechten Seite, der dem auf der linken Seite entsprechen sollte, vollendet, der knapp über dem Dach der Kirche endet. Die Erdbeben von 1832 brachten das Mittelschiff bis zum Kreuzgewölbe, Teile der Seitenschiffe und den oberen Teil der Fassade zum Einsturz, während die Kuppel und die Apsis gerettet wurden. Der Mittelpunkt der Basilika, die Kapelle der Portiunkula, erscheint als kleine Kirche direkt unter der Kuppel. Zu Beginn des 13. Jahrhunderts war die Kirche unter den Eichen, die den Benediktinermönchen von Subasio gehörten, aufgegeben worden. Um 1205 ließ sich Franziskus dort nieder, restaurierte die Kirche und gründete den Franziskanerorden. Die ersten Hütten für die Mönche aus Lehm und Schilfrohr wurden um die Portiunkula herum gebaut. Dies war der Ort, an dem sich Franziskus am häufigsten aufhielt, an dem er der heiligen Klara ihre Ordenstracht gab (1212) und an dem er das Mattenkapitel abhielt (1221), an dem mehr als 5000 Brüder teilnahmen. Der Überlieferung zufolge erhielt Franziskus hier von der Jungfrau Maria den vollkommenen Ablass. Die Portiunkula ist ein sehr einfacher rechteckiger Bau aus mehrfarbigem Stein aus Subasio. Der obere Teil der Fassade ist mit einem Fresko (Die Begnadigung von Assisi) von Friedrich Overbeck aus Lübeck (1829) bedeckt. Auf der rechten Seite befinden sich die Überreste von zwei Fresken aus dem fünfzehnten Jahrhundert mit sienesischem Einfluss: Madonna mit Kind zwischen dem Heiligen Franziskus und dem Heiligen Bernhardin. Auf der Rückseite befindet sich ein Fresko von Perugino, der Kalvarienberg (dessen oberer Teil verloren gegangen ist). Das Innere (die Türklopfer stammen aus dem 15. Jh.) weist ein Kreuzrippengewölbe auf, das durch den Rauch der Lampen etwas geschwärzt ist; am Altar die Verkündigung und die Geschichten der Vergebung, eine große Tafel von Ilario da Viterbo (1393), von dem auch das Freskenband am Gewölbe mit den Evangelisten stammt; an der linken Wand befindet sich ein Fresko der Imago Pietatis.