Das Heiligtum ist der Figur der Heiligen Margareta gewidmet, der Schutzpatronin von Cortona und Terziarin der Franziskaner, sowie der späteren kulturellen und spirituellen Tätigkeit der Franziskaner der Observanz. Nach dem Tod der Heiligen (22. Februar 1297) wurde beschlossen, ihr zu Ehren eine Kirche zu errichten, und zwar neben der alten Kirche San Basilio, die Margareta selbst restauriert hatte, nachdem sie sie als Ort der Buße und des Gebets ausgewählt hatte. Der Sakralbau wurde bereits 1304 errichtet, aber im Laufe des 14. Jahrhunderts mit bedeutenden Fresken weiter verschönert. Nur wenige Fragmente dieses Wandmalereizyklus sind bis heute erhalten geblieben und werden im Diözesanmuseum aufbewahrt. Ein Beweis dafür ist ein Kodex aus dem 17. Jahrhundert, in dem die Wandmalereien mit einundzwanzig Aquarellszenen dokumentiert sind, die 1653 aufgrund ihres schlechten Erhaltungszustandes ausgeblendet wurden. Die Analyse der erhaltenen Fragmente führt uns dazu, sie auf das Jahr 1335 zu datieren und sie der Werkstatt eines oder beider Lorenzetti-Brüder zuzuschreiben. Im Jahr 1385 wurde die Kirche den Olivetan-Mönchen anvertraut, die 1389 von den Minoriten-Observanten abgelöst wurden, die auch heute noch die Kirche betreuen und Besucher empfangen. Im August 1927 wurde sie in den Rang einer Basilika minor erhoben.