La Basílica del Santo Sepulcro se encuentra en la Vía Francigena y, según la leyenda, la iglesia fue fundada por la reina Matilde de Westfalia, que se dirigía a Roma con una caravana de mulas cargadas de oro para construir un santuario dedicado al Santo Sepulcro. En Acquapendente, las mulas supuestamente se "congelaron", arrodillándose y negándose a salir, y durante la noche la reina tuvo un sueño que la llevó a realizar su proyecto en este lugar. El edificio data del siglo XII, originalmente de estilo románico y perteneciente a la orden benedictina, con un convento anexo. El aspecto actual de la iglesia es el resultado de numerosas intervenciones: la fachada data del siglo XVIII y es obra de Nicola Salvi (arquitecto de la fuente de Trevi en Roma), luego modificada en parte debido a los daños sufridos durante la última guerra. En la fachada hay un busto del Papa Inocencio X Pamphili (el original de Alessandro Algardi se conserva en el Museo de la Ciudad), responsable del traslado de la diócesis a Acquapendente tras la destrucción de Castro. Internamente, la iglesia tiene una planta de cruz latina con tres naves; el presbiterio está elevado para dar cabida a la cripta inferior. La cripta es de tipo "hall", construida sobre 24 columnas sobre las que descansan bóvedas de crucería. Alberga un SACELLO (Santo Sepulcro) que sigue siendo destino de peregrinación, al ser la copia más antigua de la tumba de Jesús en el mundo, por lo que a Acquapendente también se le llama la Jerusalén de Europa. La copia del Santo Sepulcro data del siglo X y la cripta se construyó a su alrededor un par de siglos después. En su interior hay una piedra que, según se dice, fue llevada allí por los cruzados y bañada en la sangre de Cristo. Por ello, Acquapendente sigue siendo una parada importante en la peregrinación por la Vía Francesa.
