La basilique du Saint-Sépulcre se trouve sur la Via Francigena. Selon la légende, l'église a été fondée par la reine Mathilde de Westphalie, qui se rendait à Rome avec une caravane de mules chargées d'or pour construire un sanctuaire dédié au Saint-Sépulcre. À Acquapendente, les mules auraient " gelé ", s'agenouillant et refusant de partir, et pendant la nuit, la reine a fait un rêve qui l'a conduite à réaliser son projet dans ce lieu. Le bâtiment, qui date du 12e siècle, était à l'origine de style roman et appartenait à l'ordre bénédictin, avec un couvent attenant. L'aspect actuel de l'église est le résultat de nombreuses interventions : la façade remonte au XVIIIe siècle et est l'œuvre de Nicola Salvi (architecte de la fontaine de Trevi à Rome), puis partiellement modifiée en raison des dommages subis pendant la dernière guerre. La façade présente un buste du pape Innocent X Pamphili (l'original d'Alessandro Algardi est conservé au musée de la ville), qui fut responsable du transfert du diocèse à Acquapendente après la destruction de Castro. À l'intérieur, l'église présente un plan en croix latine avec trois nefs ; le presbytère est surélevé pour faire place à la crypte située en dessous. La crypte est de type "hall", construite sur 24 colonnes sur lesquelles reposent des voûtes d'arêtes. Il abrite un SACELLO (Saint-Sépulcre) qui est toujours une destination de pèlerinage, étant la plus ancienne copie de la tombe de Jésus dans le monde, ce qui explique pourquoi Acquapendente est également appelé la Jérusalem de l'Europe. La copie du Saint-Sépulcre date du 10e siècle et la crypte a été construite autour d'elle quelques siècles plus tard. À l'intérieur se trouve une pierre, qui aurait été apportée là par les croisés et baignée dans le sang du Christ. C'est pourquoi Acquapendente est toujours une étape importante du pèlerinage sur la Via Francigena.
