O santuário é dedicado à figura de Santa Margherita, padroeira de Cortona e Franciscana terciária, e a subsequente atividade cultural e espiritual dos Franciscanos observadores. Com a morte da Santa (22 de fevereiro de 1297) foi decidido construir uma igreja em sua honra, ao lado da antiga Igreja de San Basilio que Margherita havia restaurado depois de escolhê-la como um lugar de penitência e oração. Em 1304, o edifício sagrado já foi construído, mas continuou a ser embelezado com afrescos importantes ao longo do século XIV. Apenas alguns fragmentos deste ciclo mural chegaram até nós no Museu Diocesano, mas a evidência disso está preservada em um código do século XVII que documenta com vinte e um cenas aquareladas as pinturas na parede perdidas em 1653 quando, devido ao seu mau estado de conservação, foram lavadas. A análise dos fragmentos sobreviventes leva a datá-los por volta de 1335 e atribuí-los à Oficina de um ou ambos os irmãos Lorenzetti. Em 1385, a igreja foi confiada aos monges Olivetanos, substituída em 1389 pelos menores observantes que ainda cuidam dela e acolhem os visitantes. Em agosto de 1927 foi elevada à dignidade da Basílica Menor.
