Die Basilika des Heiligen Grabes liegt an der Via Francigena und wurde der Legende nach von Königin Mathilde von Westfalen gegründet, die mit einer Karawane von Maultieren, die mit Gold beladen waren, auf dem Weg nach Rom war, um ein dem Heiligen Grab geweihtes Heiligtum zu errichten. In Acquapendente sollen die Maultiere "erstarrt" sein und sich geweigert haben, wegzugehen, und in der Nacht hatte die Königin einen Traum, der sie dazu veranlasste, ihr Projekt an diesem Ort zu verwirklichen. Das Gebäude stammt aus dem 12. Jahrhundert und war ursprünglich im romanischen Stil gehalten und gehörte dem Benediktinerorden mit einem angrenzenden Kloster. Das heutige Aussehen der Kirche ist das Ergebnis zahlreicher Eingriffe: Die Fassade stammt aus dem 18. Jahrhundert und ist ein Werk von Nicola Salvi (Architekt des Trevi-Brunnens in Rom), das dann aufgrund von Schäden während des letzten Krieges teilweise verändert wurde. An der Fassade befindet sich eine Büste von Papst Innozenz X. Pamphili (das Original von Alessandro Algardi wird im Stadtmuseum aufbewahrt), der für die Verlegung der Diözese nach Acquapendente nach der Zerstörung von Castro verantwortlich war. Das Innere der Kirche hat den Grundriss eines lateinischen Kreuzes mit drei Schiffen; das Presbyterium ist erhöht, um Platz für die darunter liegende Krypta zu schaffen. Die Krypta ist eine Art Halle, die auf 24 Säulen gebaut ist, auf denen Kreuzgewölbe ruhen. Es beherbergt ein SACELLO (Heiliges Grab), das immer noch ein Pilgerziel ist, da es die älteste Kopie des Grabes Jesu in der Welt ist, weshalb Acquapendente auch das Jerusalem Europas genannt wird. Die Kopie des Heiligen Grabes stammt aus dem 10. Jahrhundert und die Krypta wurde einige Jahrhunderte später um sie herum gebaut. Im Inneren befindet sich ein Stein, der von den Kreuzfahrern dorthin gebracht und mit dem Blut Christi getränkt worden sein soll. Aus diesem Grund ist Acquapendente auch heute noch eine wichtige Etappe auf der Pilgerreise entlang der Via Francigena.
